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多重探针法qPCR预混液(2×BAPA3G Multiplex Probe qPCR Mix)将热启动BAPA3G DNA聚合酶、反应Buffer、dNTP染料等试剂预混在一起，是一种2×浓度的单组分预混试剂。该制品不含有ROX校正染料，适用于各种荧光标记探针，并且适用于各种定量PCR机型。优化的反应缓冲液，使得本制品不仅可用于单重的探针法定量PCR，还允许进行多重定量PCR（MultiPlex qPCR）检测，本制品可进行4重以上的定量PCR检测。

本制品中的BAPA3G DNA聚合酶为第三代DNA聚合酶，其具有最高的杂质耐受性，其对乙醇、胍盐、肝素、血清、植物多糖多酚具有极高的耐受性，因此可用于粗样品的直接定量PCR检测(Direct PCR)。该酶经化学法修饰，在50℃以下100%无活性，只有95℃条件下加热5min后才能完全恢复酶的活力。因此该系统可以有效抑制非特异性PCR扩增，极大的提高了PCR扩增特异性。

• BAPA3G DNA聚合酶强劲的扩增性能，可用于4重以上的qPCR扩增。
  
• 杂质高耐受性，使用各种gDNA和cDNA，具有最佳的扩增成功率。
  
• 高灵敏度，宽范围的动态检测（>7个数量级）。
  
• 反应效率在95～110%之间，高准确度和重现性。
  
• 扩增程序40min内完成，具有10s扩增1kb的快速能力。
  
• 在不同的富含AT和GC目标物上产生更高的荧光检测。

基因分型、RNA转录的cDNA、基因组DNA、病毒DNA等定量检测。

组分	1mL	5mL	25mL
2×BAPA3G Multiplex Probe qPCR Mix	1mL	5×1mL	25mL
说明书	1份

保存：-20℃，避光，有效期3年。


请避光置于-20℃以下可保存3年。该试剂经30次冻融后性能无下降，因此不使用时请置于-20℃避光保存。



图1．四重引物、探针检测。分别以nCoV S基因质粒（蓝线- FAM通道）、nCoV N基因质粒（绿线- VIC通道）、nCoV ORF1ab基因质粒（红线- Cy5通道）和人GAPDH内参Hela cDNA(黄线- ROX通道）为模板，四对引物和四条探针在同一体系内进行检测，模板均使用10e8～100copy/Test(7个数量级)，A为四重检测扩增曲线和标准曲线，C-E为单独每一个通道的性能展示，结果可见2×BAPA3G Multiplex Probe qPCR Mix在7个数量级的动态检测中表现出卓越的扩增性能，各个通道之间区分良好。

• 配制qPCR反应体系
  按下表加入各成分配制20μL qPCR反应体系：
  

  成分	用量	终浓度
  2×BAPA3G Multiplex Probe qPCR Mix	10μL	1×
  Primer F1 (20μM)	0.1～0.4μL	0.1～0.4μM
  Primer R1 (20μM)	0.1～0.4μL	0.1～0.4μM
  Probe1 (20μM)	0.1～0.4μL	0.1～0.4μM
  其它引物和探针	X	-
  DNA模板	0.5～2μL	-
  ddH2O	至20μL	-

  • 在进行单重qPCR检测时，通常引物和探针用量在0.2μL（0.2μM）时一般具有较高的效果。
    
  • 在进行多重定量PCR时，通常首先进行单重检测，通过单重检测结果来评估引物和探针的效率、特异性等情况后，再进行引物、探针组合进行多重检测。
• qPCR反应程序
  
  • 两步法：进行Real-Time PCR反应，通常采用两步法，程序如下：
    

    步骤	循环数	温度	时间	过程	说明
    Stage 1	1	95℃	5min	热启动
    Stage 2	40	95℃	5sec	变性
    		60℃	30sec	退火/延伸	收集信号

  • 三步法：在多数情况下，采用两步法程序可获得理想的扩增效果，在无法达到预期理想效果的情况下，也可采用三步法PCR程序，程序如下：
    

    步骤	循环数	温度	时间	过程	说明
    Stage 1	1	95℃	5min	热启动
    Stage 2	40	95℃	5sec	变性
    		55℃	10sec	退火
    		72℃	30sec	延伸	收集信号

• 反应结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线和标准曲线。

BAPA3G DNA聚合酶对抑制物耐受性：

SDS	0.01%	Serum	2%
EtOH 5%	Plasma	Citrate	2%
Heparin	0.1 IU/ml	Gua SCN	0.25%
Hematin	30μM	Trizol	0.5%

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